1 Введение
Для определения молекулярно-массового распределения полимеров используется эксклюзионный режим хроматографирования (частные названия – Гель-проникающая хроматография (ГПХ), гель-фильтрационная хроматография (ГФХ)). Эксклюзионная хроматография основана на исключении молекул определенного эффективного диаметра из пор с меньшим диаметром. В результате крупные молекулы проходят меньший путь внутри пор, и элюируются раньше мелких.
Благодаря зависимости времени удерживания от размера молекул возможно определение молекулярной массы исследуемого образца.
Режим ГПХ не используется для количественного определения содержания компонентов. В режиме ГПХ определяется распределение молекул анализируемой смеси по их молекулярным массам. Расчет проводится в разделе спецрасчетов.
Расширение "Специальные расчёты" является неотъемлемой часть программного обеспечения "Хроматэк Аналитик" и отдельно не поставляется.
В различных документах "Хроматэк" модуль "Специальные расчёты" также может именоваться "приложением" или "расширением". Эти термины в данном случае следует рассматривать, как синонимы, каждый из них был актуален на определённом этапе эволюции программного обеспечения. В настоящее время функционал настройки специальных расчётов реализован в редакторе метода, вкладка Отчёт. Определение "приложение Специальные расчёты" не предполагает, что данный программный модуль функционирует автономно от "Хроматэк Аналитик".
2 Принцип метода
В эксклюзионной хроматографии молекулы разделяются по размеру. Крупные молекулы не могут попасть в мелкие поры сорбента и поэтому движутся быстрее по колонке.
Рисунок 1 – принцип эксклюзионной хроматографии
Эксклюзионная хроматограмма начинается, когда самые большие молекулы достигают межгранульного объёма колонки, и заканчивается, когда самые маленькие молекулы достигают мёртвого объёма колонки (максимального удерживаемого объема колонки).
\(V_{0} = V_{мг} \times V_{п}\),
Где:
Vмг – межгранульный объем колонки;
Vп – объем пор колонки.
После мёртвого времени никаких соединений элюироваться с хроматографической колонки не должно.
В эксклюзионной хроматографии размер молекулы соединения оценивают по логарифму его молекулярной массы.
График зависимости времен удерживания фракций полимеров от логарифма молекулярных масс соединений (для конкретной эксклюзионной колонки и типа разделяемых соединений) называется калибровочной кривой.
Рисунок 2 – Зависимость объема эксклюзии (времени удерживания) от логарифма молекулярной массы
Её не следует путать с градуировочной кривой для количественного анализа, которая является зависимостью отклика детектора от концентрации вещества.
3 Расчеты
3.1 Калибровка системы
Термин "время удерживания" для эксклюзионного режима как правило не применяют, поэтому чаще используется термин "объем эксклюзии".
В условиях работы постоянства потока допускается по-прежнему оперировать временем удерживания для расчетов.
Как опция требуется возможность отображения данного объема по оси абсцисс вместо времени удерживания.
Расчет объема эксклюзии осуществляется по формуле
\(V_{R} = t_{R} \bullet v_{об}\),
Где:
\(t_{R}\)– время удерживания, мин;
\(v_{об}\)– объемная скорость потока элюента, мл/мин (из режима прибора.)
3.2 Коррекция потока
Погрешность скорости потока растворителя должна быть не более 0,3% от скорости, полученной при калибровке. Для коррекции используется внутренний стандарт.
При использовании внутреннего стандарта скорректированый объем эксклюзии (время) рассчитывается по формуле:
\(V_{Rскорр.} = {V_{R}}^{'} \bullet \frac{V_{Rст}}{V_{Rст}^{'}}\),
\[t_{Rскорр.} = {t_{R}}^{'} \bullet \frac{t_{Rст}}{t_{Rст}^{'}}\]
Где:
\(V_{Rст}\) и \(t_{Rст}\)– объем эксклюзии и время удерживания, соответственно, внутреннего стандарта, полученный при калибровке.
\(V_{Rст}^{'}\) и \(t_{Rст}^{'}\)– объем эксклюзии и время удерживания, соответственно, внутреннего стандарта в анализе.
3.3 Калибровка по узким стандартам
Наиболее используемой является калибровка по узкодисперсным образцам исследуемого полимера (Mw/Mn ≤ 1,1). В этом случае хроматографируют ряд стандартов (желательно по два раза каждый стандартный образец), перекрывающих требуемый диапазон молекулярных масс, измеряют удерживаемые объемы в максимумах пиков и строят зависимость логарифма молекулярной массы от удерживаемого объема, получая калибровочную кривую. Чаще всего это S-образная кривая, которую аппроксимируют полиномом (обычно достаточно полинома третьей степени).
Рисунок 3 – Хроматограмма в эксклюзионном режиме (а) и калибровочная кривая (б)
Точка А соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки Vм. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vм. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем \(V_{i}\) принято называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок частной калибровочной кривой, построенной в координатах VR– lgM.
\[V_{i} = V_{t} - V_{M}\]
Этот участок описывается уравнением
\[\log_{10}M = S_{0} + SV_{R}\]
Где:
S0 – отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрезка CD,
S – тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.
Рисунок 4 – Калибровочная кривая в ПО Хроматэк Аналитик
3.4 Универсальная калибровка
\[\text{log}M_{2} = \left\lbrack \frac{1}{1 + \alpha_{2}} \right\rbrack \cdot \text{log}\left( \frac{K_{\eta 1}}{K_{\eta 2}} \right) + \left\lbrack \frac{1 + \alpha_{1}}{1 + \alpha_{2}} \right\rbrack \cdot \text{log}M_{1}\]
Разделение полимеров совершенно различного состава и строения возможно описать единой калибровочной кривой в координатах VR – lg([η]·M).
На практике на основе универсальной калибровки легко рассчитать калибровочную зависимость для любого полимера, если известны значения констант Марка—Куна—Хаувинка Кη и α для эталонного и исследуемого полимера в используемом растворителе при температуре разделения.
Где:
Kη и α — константы уравнения Марка-Хаувинка;
Индексы 1 и 2 относятся соответственно, к имеющемуся в наличии эталонному и исследуемому полимеру.
3.5 Расчет анализа
В результате, из данных эксклюзионной хроматографии можно найти средние молекулярные массы разной степени усреднения.
3.5.1 Средние ММ
На рисунке представлен типичный пример хроматограммы полимерного образца, подготовленный для расчета средних ММ, а именно, проведена базовая линия, определяющая начало и конец хроматограммы, и затем хроматограмма разбита на равные доли вдоль оси времени, так называемые слайсы.
Рисунок 5 – Интегрирование пика
Для каждого слайса определяется его площадь Ai, молекулярная масса Mi, соответствующая его середине, вычисляется из калибровочной зависимости. Затем вычисляются средние молекулярные массы по следующим уравнениям:
\({\overline{M}}_{n} = \frac{\sum_{i}^{}A_{i}}{\sum_{i}^{}\left( \frac{A_{i}}{M_{i}} \right)}\),
\({\overline{M}}_{w} = \frac{\sum_{i}^{}{A_{i}M_{i}}}{\sum_{i}^{}A_{i}}\),
\({\overline{M}}_{z} = \frac{\sum_{i}^{}{A_{i}M_{i}^{2}}}{\sum_{i}^{}{A_{i}M_{i}}}\),
Где:
\({\overline{M}}_{n}\) – среднечисленная ММ,
\({\overline{M}}_{w}\) – среднемассовая ММ,
\({\overline{M}}_{z}\) – z-средняя ММ.
Рисунок 6 Вид окна с результатами в программе Хроматэк Аналитик
3.5.2 Расчет характеристической вязкости
Для измерения характеристической вязкости полимера в растворе используется ASTM D 2857. Значение [\(\eta\)] связано с молекулярной массой полимера уравнением Марка-Хаувинка:
\(\lbrack\eta\rbrack = KM_{v}^{a}\),
Где:
K и \(a\) константы для выбранной системы при заданной температуре.
\(M_{v}\) – средневязкостная масса.
Средневязкостная масса рассчитывается по формуле:
\[M_{v} = \left\lbrack \frac{\sum_{i = 1}^{N}{A_{i}M_{i}^{a}}}{\sum_{i = 1}^{N}A_{i}} \right\rbrack^{\frac{1}{a}}\]
Значения K и \(a\), для полистирола в ТГФ при 25°C: K = 0.016 мл·г−1\(\lbrack\eta\rbrack\)= 0.706.5
3.5.3 Показатель полидисперсности
Полидисперсность характеризует интервал изменения молекулярных масс и относительное содержание молекул с промежуточными молекулярными массами.
Если образец монодисперсен, то КD=1. Для большинства синтетических и природных полимеров КD>1, т.е. полимеры полидисперсны, причём КD может изменяться в широких пределах (от 2 до 20).
Рисунок 7 – Кривые молекулярно-массового распределения образцов
полимера с меньшей (1) и большей (2) полидисперсностью
Расчет показателя полидисперсности:
\[K_{D} = \frac{{\overline{M}}_{w}}{{\overline{M}}_{n}}\]
3.5.4 Молекулярно-массовое распределение: кумулятивная (интегральная) функция
Кумулятивное ММР – отношение проинтегрированных площадей для различных молекулярных масс к общей площади под хроматограммой. Данное отношение соответствует массовой доле полимера Wi с большим объемом эксклюзии Vi и меньшей молекулярной массой, чем Mi.
Для графического отображения строится график в осях Wi и log10 Mi.
Если высота пика (H) измерена и интервал элюирования Vi постоянны, кумулятивное распределение растворенного образца с молекулярной массой меньшей и равной Mi устанавливается по формуле:
\[W_{i} = 1 - \sum_{j = 1}^{i}{H_{N,j} = 1 - \frac{\sum_{j = 1}^{i}H_{j}}{\sum_{j = 1}^{N}H_{j}}}\]
Рисунок 8 – Кумулятивная кривая молекулярно-массового распределения в программе Хроматэк Аналитик
3.5.5 Молекулярно-массовое распределение: дифференциальная функция.
По определению дифференциальная массовая функция ММР – fw(М) равна отношению массовой доли макромолекул dW, лежащей в интервале от М до М + dM, к значению этого интервала (dM).
Определяется соотношением fw(М) = dw/dM, где dw – массовая доля макромолекул молекулярной массы.
Дифференциальные ММР fw(M) и Fw(log10M).
При правильном расчете графики для одного образца, полученные при помощи разных систем обработки данных в осях fw(M) или Fw(log10M) и log10M должны быть одинаковыми.
Расчет распределения:
\[F_{w}\left( \log_{10} \right)M_{i} = - H_{N,i}\frac{d\log_{10}M}{dV}\]
Также может быть рассчитано по формуле:
\[\frac{dW}{d\log_{10}M} = \log_{10}M\]
Рисунок 9 – Дифференциальная кривая молекулярно-массового распределения в программе Хроматэк Аналитик
4 Работа с расчетом
4.1 Получение лицензии
Большинство расчётов, входящих в состав приложения "Специальные расчёты" защищено от несанкционированного распространения программным ключом.
Для использования этих расчётов необходимо получить лицензию.
Если Вы ранее использовали ПО "Хроматэк Аналитик 3.1" и получали лицензию для специальных расчётов, этот факт не помешает получить лицензию для "Хроматэк Аналитик 4".
Файлы лицензий для версий 3 и 4 различны. Лицензий для версии 3 привязана к некоему идентификатору компьютера (вычисляется на основе серийного номера процессора). Лицензия для версии 4 привязана к серийному номеру хроматографа.
Это означает, что для версии 3 лицензий нужно столько, сколько вы используете компьютеров при работе с хроматографом, а для версии 4 вы получаете одну лицензию на хроматограф и можете работать с ним с любого компьютера.
Получение лицензии:
 |
На рабочем столе "Хроматэк Навигатор" нажмите на кнопку "Лицензии". Откроется страница запроса лицензии. |
|---|
Для создания запроса лицензии введите:
Пароль. Он находится в коробке с USB-носителем. Если его там нет – убедитесь, что вы приобретали пакет специальных расчётов. Можете уточнить этот вопрос в коммерческом отделе СКБ "Хроматэк" по телефонам 8(8362) 68-59-69 и 8(8362) 68-59-70.
Ваш email. На него будет отправлен файл лицензии.
Через запятую перечислите серийные номера ваших приборов.
 |
Добавьте идентификатор специального расчёта "Полимер". |
|---|---|
 |
Если ваш компьютер подключен к интернету, нажмите на кнопку "Активировать лицензию онлайн". |
Если онлайн-активация окончилась неудачей, вы получите сообщение:
"В активации лицензии отказано. Скорее всего вы уже активировали все доступные лицензии. Если это не так, отправьте строку запроса на почту soft@chromatec.ru".
В этом случае воспользуйтесь оффлайн-активацией.
Оффлайн-активация также доступна при отсутствии интернета.
На экране появится QR-код. Вы можете отсканировать его смартфоном и получите ссылку. Пройдя по этой ссылке, вы отправите запрос в "Хроматэк". При успешной активации файл лицензии будет скачан на смартфон. Вам останется перенести его на компьютер и активировать (см. далее).
 |
Если по какой-либо причине вы не можете воспользоваться QR-кодом – скопируйте в буфер обмена строку запроса и отправьте её на любой из адресов: |
|---|---|
 |
Когда вам пришлют по электронной почте файл лицензии *.lic (или вы загрузите его со смартфона), нажмите на кнопку "Активировать лицензию оффлайн" и выберите данный файл. Лицензия будет активирована. |
5 Настройка специальных расчётов
Результатом выполнения расчётов параметров определяемых полимеров являются дополнительные секции отчётов, поэтому чтобы применить специальные расчёты, вам нужно войти в редактор метода и добавить их в отчёт.
В видео ниже показан пример настройки расчётов по ГОСТ 31371.7-2020 и ГОСТ 31369-2021:
5.1 Секция Полимер
Рисунок 10 – Настойка секций отчета
5.1.1 Градуировочные хроматогаммы
Укажите список градуировочных хроматограмм. Это должны быть хроматограммы с назначением "Градуировка" в паспорте.
Секция выводит в отчёт таблицу входных данных со списком использованных хроматограмм вида:
| Градуировочные хроматограммы | ||||
|---|---|---|---|---|
| 2025-07-23 10:56:40 | #30 | Град. р-р (ст. полистирола в ТГФ) | ||
| 2025-07-24 13:47:48 | #31 | Град. р-р (ст. полистирола в ТГФ) |
Здесь #30, #31 – номера выбранных хроматограмм.
5.1.2 Ось абсцисс
В данном поле выбираются тип значений для расчета при анализе и калибровке – время удерживания или объем эксклюзии. Выбранное значение будет откладываться на графике хроматограммы.
5.1.3 Надписи над пиками
В данном поле выбираются значения, отображаемые на хроматограмме.
Рисунок 11 – Надписи над пиками
Формат округления. Выбор формата вывода значений.
Высота диаграммы. Высота графиков, отображаемых в отчете.
Не показывать в отчете. В данном поле можно выбрать секцию, которую не требуется отображать в отчете.
Рисунок 12 – Выбор неотображаемых секций отчета
С новой страницы. Для PDF формата секция начинается с новой страницы.
5.2 Паспорт хроматограммы
Для корректировки потока подвижной фазы в паспорт хроматограммы необходимо добавить пользовательское поле с ключом Flow, тип – Число
Рисунок 13 – Настройка паспорта хроматограммы
6 Проведение измерений
6.1 Калибровка системы и создание метода
Проведите анализ калибровочных смесей.
Рисунок 14 – Калибровочная хроматограмма
Заполните паспорт хроматограммы. Укажите признак "Градуировка" и объемую скорость потока подвижной фазы, мл/мин.
Рисунок 15 – Калибровочная хроматограмма
В редакторе метода настройте разметку пиков стандартной смеси и проведите идентификацию компонентов.
В режиме ГПХ, как правило, в качестве стандартов используется смесь одного и того же полимера с фракциями различной молекулярной массы. В качестве названия компонента удобно использовать именно молекулярную массу.
Рисунок 16 – Создание компонентов
Настройте события интегрирования. Рекомендуется запретить разметку до верхнего и после нижнего предела эксклюзии.
Рисунок 17 – Настройка событий интегрирования
Добавьте процесс "Полимер" во вкладке Обработка. Выберите константы Марка—Куна—Хаувинка K и Альфа, соответствующие калибровочным растворам и подвижной фазе.
Рисунок 18 – Константы Марка—Куна—Хаувинка K и Альфа
При необходимости можно внести дополнительные константы в Редакторе коэффициентов
Рисунок 19 – Константы Марка—Куна—Хаувинка K и Альфа
При наличии внутреннего стандарта в калибровочной смеси – его необходимо указать для корректной коррекции потока.
Рисунок 20 – Выбор внутреннего стандарта
При необходимости добавьте хроматограммы с параллельными анализами или хроматограммы с другим наборов стандартов.
Проведите расчет метода и сохраните его.
6.2 Проведение измерений
Выполните анализ раствора образца. При необходимости добавляется внутренний стандарт для коррекции значения скорости потока.
Рисунок 21 – Хроматограмма полимерной смеси
Настройте разметку хроматограммы.
Рисунок 22 – Разметка хроматограммы
Т.к. результатом анализа являются средние молекулярные массы и кривые молекулярно-массового распределения, разметка как правило делается одним пиком.
Внутренний стандарт, используемый для коррекции значения скорости потока, размечается отдельным пиком
Создайте отчет анализа.
